應用案例

應用簡(jiǎn)介：

本研究利用His標簽蛋白純化磁珠，純化帶有His6- MBP標簽的Cas1、Cas2、Cas4 三個(gè)蛋白，結合MBP Pull-down分析，揭示Cas1、Cas2、Cas4 三個(gè)蛋白間的互作關(guān)系。

文獻解析：

2021年2月22日，四川大學(xué)華西醫院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗室陳強教授團隊，在Nucleic Acids Research（IF=11.501）在線(xiàn)發(fā)表了標題為“Mechanisms of spacer acquisition by sequential assembly of the adaptation module in Synechocystis”的研究成果。該團隊研究人員通過(guò)利用His標簽蛋白純化磁珠（BeaverBeads^? IDA-Nickel cat. 70501），純化帶有His 6-MBP標簽的Cas1、Cas2、Cas4 三個(gè)蛋白，結合MBP Pull-down（圖1）分析及其他生物化學(xué)實(shí)驗，揭示了Cas1、Cas2、Cas4 三個(gè)蛋白間的互作關(guān)系，并且解析了Cas1-Cas2-Spacer三元復合物的晶體結構（圖2）和Cas1-Cas4二元復合物的電鏡負染結構（圖3），闡明了Cas4參與外源DNA捕獲與整合的新機制。

圖1.MBP pull-down 分析

圖2.Cas1-Cas2-Spacer三元復合物結構

圖3.Cas1-Cas4二元復合物結構

該團隊認為，在I-D 型系統中， Cas4和Cas2會(huì )競爭性地與Cas1結合，可以形成 Cas1-Cas4和 Cas1-Cas2-Spacer 兩種復合物，這兩種復合物按次序先后參與間隔序列的整合。I-D型系統的間隔序列整合分為兩個(gè)步驟：1）間隔序列的加工；2）間隔序列的整合。在此過(guò)程中，Cas1-Cas4復合物通過(guò)Cas4的PAM序列特異性的內切酶活性對間隔序列進(jìn)行識別和加工，加工成熟的間隔序列又與Cas1、Cas2形成比Cas1-Cas4復合物更加穩定的Cas1-Cas2-Spacer復合物，將間隔序列插入到CRISPR位點(diǎn)，完成間隔序列的整合。

CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于全球實(shí)驗室，對CRISPR-Cas系統更加深入的了解不僅拓寬了人類(lèi)的知識邊界，還有助于開(kāi)發(fā)更新一代的基因編輯工具。（部分內容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )）

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