磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析
化學(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種測定方式，其利用化學(xué)反應釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會(huì )釋放等能級的光子，對光子進(jìn)行測定而進(jìn)行定量分析?；瘜W(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，并且避免了放射分析存在環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。
磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析簡(jiǎn)介
免疫診斷的發(fā)展歷史[建議把免疫診斷發(fā)展史放在文章開(kāi)頭，專(zhuān)題的邏輯可以如下：
免疫學(xué)發(fā)展史——化學(xué)發(fā)光技術(shù)——化學(xué)發(fā)光免疫分析——磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析]
免疫學(xué)的發(fā)展史起始于微生物學(xué)研究，于18世紀建立，19 世紀至 20 世紀中期進(jìn)入經(jīng)典發(fā)展期。這一時(shí)期，人們對免疫功能的認識由人體現象的觀(guān)察進(jìn)入了科學(xué)實(shí)驗時(shí)期。20世紀初期到中期，進(jìn)入近代免疫學(xué)時(shí)期。從20世紀中期開(kāi)始，真正進(jìn)入現代免疫學(xué)時(shí)期?，F代免疫學(xué)的檢測基本歷經(jīng)了以下幾個(gè)過(guò)程，如圖1所示。
圖1.免疫檢測技術(shù)的發(fā)展史
免疫學(xué)檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應進(jìn)行檢測，利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對檢測信號進(jìn)行放大和顯示，常被用于檢測蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。各類(lèi)免疫學(xué)檢測方法的性質(zhì)及發(fā)展狀況詳見(jiàn)表格1。免疫診斷在臨床診斷中占據著(zhù)非常重要的地位，但是從我國臨床免疫診斷現狀來(lái)看，其步伐都落后于發(fā)達國家，亟待改進(jìn)。
| 放射性免疫 | 酶聯(lián)免疫 | 化學(xué)發(fā)光 | 電化學(xué)發(fā)光 | 納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光 | |
| 檢測靈敏度 | 10-15 | 10-13 | 10-15- 10-18 | 10-17 | 10-21 |
| 精密度（批間差） | ＞15% | 10%-15% | ＜10%-15% | 5% | ＜10% |
| 線(xiàn)性范圍 | 105 | 102 | 106-7 | 107 | 107 |
| 檢測時(shí)間 | 3-4小時(shí) | 2-3小時(shí) | 65分鐘 | 10分鐘 | 18-40分鐘 |
| 放射污染 | 有 | 無(wú) | 無(wú) | 無(wú) | 無(wú) |
| 操作 | 手工 | 手工/批量自動(dòng)化 | 手工/全自動(dòng) | 全自動(dòng) | 全自動(dòng) |
| 有效期 | 2個(gè)月 | 6-12個(gè)月 | 12個(gè)月 | 12個(gè)月 | 12個(gè)月 |
| 定性/定量 | 定量 | 定性/半定量 | 定量 | 定量 | 定量 |
| 發(fā)展趨勢 | 環(huán)境污染，國內處于衰退期；歐美已經(jīng)完全淘汰。 | 國內處于成熟期；歐美處于衰退期。 | 國內處于導入期和成長(cháng)期；歐美處于成熟期。 | 可使用項目廣泛，羅氏專(zhuān)利技術(shù)。 | 各項目可隨機組合使用，國內處于發(fā)展期。 |
表1. 各類(lèi)免疫檢測技術(shù)的性質(zhì)及優(yōu)缺點(diǎn)
化學(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種測定方式。該技術(shù)的原理是利用化學(xué)反應釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會(huì )釋放等能級的光子，對光子進(jìn)行測定而進(jìn)行定量分析（見(jiàn)圖2）?；瘜W(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。
圖2. 化學(xué)發(fā)光基本原理示意圖
化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是一種高度敏感的微量測定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用CLIA測定。CLIA起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代具備以下特點(diǎn) ：
①高度敏感，極限達10-17－10-19mol/L，遠高于放射性免疫（RIA）、酶聯(lián)免疫（EIA）。與時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當，但比TRFIA便宜。
②特異性強，重復性好CV＜10％。
③測定范圍寬，可達7個(gè)數量級。
④試劑穩定性好，無(wú)污染有效期12月。
⑤操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。
磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結合起來(lái)的一種新興分析方法，其基本原理見(jiàn)圖3 。該技術(shù)充分利用了磁性分離技術(shù)的快速易自動(dòng)化性，化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性，在生物分析領(lǐng)域展現了不可替代的作用。
圖3. 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測（雙抗夾心法）原理示意圖
目前磁微?；瘜W(xué)分析免疫分析已經(jīng)應用于管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測項目以及電化學(xué)發(fā)光免疫檢測項目。
能夠用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的磁珠種類(lèi)
按材質(zhì)分：
| 材質(zhì) | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
| 磁性瓊脂糖微球 |
1. 親水性強，溫和的條件容易洗脫，不至于引起酶失活或蛋白質(zhì)變性 2. 表面惰性，非特異性吸附低，受pH影響小 3. 容量大，具有開(kāi)放性的支撐骨架 4. 組織相容性好 |
1. 機械性能和力學(xué)性能較差 2. 溶脹程度會(huì )隨溶劑性質(zhì)變化 |
| 磁性二氧化硅微球 |
1. 機械強度相對較強 2. 化學(xué)穩定性較優(yōu) |
1. 硅膠自身結構空隙較多，容易造成表面大量的水存積，增加了化學(xué)反應的復雜性 2. 堿性條件下非常不穩定 3. 存在較大的非特異性吸附性 |
| 磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸類(lèi)高分子微球 |
1. 具有較好的親水性 2. 良好的血液相容性 3. 與其他高分子化合物共聚，改善其力學(xué)性能和穩定性 | 收縮過(guò)大，易產(chǎn)生縮孔 |
| 磁性聚苯乙烯微球 |
1. 機械強度高 2. 表面易功能化 3. 表面非離子相互作用弱 4. 交聯(lián)聚苯乙烯能夠在強酸強堿中保持穩定的結構 5. 微球粒徑大小可控 | 聚苯乙烯微球表面為疏水性，對某些蛋白存在非特異性，需要對表面進(jìn)行功能化修飾 |
按照官能團分：
| 磁珠種類(lèi) | 常見(jiàn)活化方法 | 配體的反應位點(diǎn) |
| 羥基磁珠 | CDI活化、溴化氰 | 氨基 |
| 羧基磁珠 | EDC活化，NHS活化 | 氨基 |
| 氨基磁珠 | 戊二醛活化 | 氨基 |
| 環(huán)氧基磁珠 | —— | 巰基、氨基 |
| NHS磁珠 | —— | 氨基 |
| SA磁珠 | 配體生物素標記 | 生物素 |
海貍磁珠應用于化學(xué)發(fā)光免疫檢測機理
| 免疫吸附種類(lèi) | 原理 | 舉例 |
| 磁性微球表面固定抗原 | 將抗原固定在微球表面，吸附相應的抗體和殘留有抗體活性的免疫復合物 | Mag COOH(70102) Mag NHS(70701) |
| 磁性微球表面固定抗體 | 將抗體固定在微球表面，吸附相應的抗原和殘留有抗原活性的免疫復合物 | Mag COOH(70102) Mag NHS(70701) |
| 磁性微球表面固定補體 | 利用補體Clq與免疫復合物的Fc段結合吸附免疫復合物，如DNA-抗DNA抗體復合物 | _ |
| 磁性微球表面固定蛋白A/G/L | 蛋白A/G/L固定在磁性微球表面，可吸附抗體和免疫復合物 | Mag protein A （22203） Magrsoe ProteinA/G（22202） |
| 疏水結合型 | 磁珠表面為疏水性材質(zhì)，能夠與目標生物分子疏水作用力結合磁珠表面具有疏水性配體，能夠與目標生物分子共價(jià)作用力結合 | 對甲苯磺?；胖?疏水蛋白 聚苯乙烯微球+磷酯類(lèi)蛋白 |
| 靜電結合型 | 配體與被吸附物靠靜電作用而結合。 | 磁性微球表面為帶陰離子基團的甲基白蛋白，可靜電結合帶陽(yáng)離子基團的DNA-抗DNA抗體復合物 |
磁珠用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的方法
間接法
間接法就是包被抗原，然后用酶標記的抗抗體檢測樣本中抗體，基本原理見(jiàn)圖4，適合于檢測對象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點(diǎn)：相對較方便，只要變換包被抗原就可以檢測不同的項目。間接法的缺點(diǎn)：標本中的特異性抗體會(huì )競爭性的結合抗原，使結果出現假陰性。
圖4. 采用間接法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入樣本（含目標抗體）孵育，清洗。
c)加入酶標抗抗體孵育，清洗。
d)加發(fā)光底物，檢測信號。
捕獲法
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì )干擾IgM抗體的測定，因此測定IgM抗體多用捕獲法?；驹砣鐖D5所示，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后測定特異性IgM。
圖5. 采用捕獲法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)將抗人IgM抗體連接在固相載體上形成固相抗人IgM，洗滌。
b)加入稀釋的血清標本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
c)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合洗滌。
d)加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合洗滌。
e)加底物顯色，檢測信號。
固相抗原競爭法
競爭法，是指受檢抗體和酶標抗體競爭性的與磁珠表面抗原結合。固相抗原競爭法基本原理如圖6所示。結合于固相載體的酶標抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無(wú)抗體，酶標抗體能夠順利與抗原結合，出現強信號。若受檢樣本中有抗體，則競爭性的占去了酶標抗體與抗原的結合，酶標抗體的結合力減弱，信號強度減弱。
圖6. 采用固相抗原競爭法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)磁珠表面固定特異性抗原。
b)加受檢標本和酶標抗原的混合液孵育。
c)加發(fā)光底物，檢測信號。
雙抗夾心（兩步法）
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，基本原理如圖7所示。
圖7. 采用雙抗夾心法（兩步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜。
b)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時(shí)問(wèn)，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質(zhì)。
c)加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)。
d)加發(fā)光底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據顏色反應的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
雙抗夾心法（一步法）
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hook effect），類(lèi)同于沉淀反應中抗原過(guò)剩的后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應嚴重時(shí)甚至可出現假陰性結果（如圖8， 雙抗夾心法及雙位點(diǎn)一步法。缺點(diǎn)：假陰性）
圖8. 采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
圖9. 采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，當樣本中抗原量較多是，容易出現假陰性。
操作步驟：
a)磁珠表面固定一抗。
b)加樣本和酶標二抗孵育，清洗。
c)加發(fā)光底物，檢測信號。
海貍產(chǎn)品優(yōu)勢
領(lǐng)先的表面技術(shù)
蘇州海貍生物醫學(xué)工程有限公司，掌握先進(jìn)的生物納米表面技術(shù)，能夠保證蛋白的覆蓋率、有效控制蛋白質(zhì)的定向包被、充分表露蛋白的活性位點(diǎn)。生物納米表面技術(shù)成功將生物技術(shù)與納米技術(shù)融合，明顯改善一些生物材料表面的非特異性吸附現象。通過(guò)近4年的技術(shù)沉淀，已經(jīng)申請相應專(zhuān)利12篇。
海貍公司生物納米表面技術(shù)，能夠保證蛋白的定向性，以及活性位點(diǎn)的充分暴露。
左圖普通技術(shù)包被的磁珠，表面抗體呈現雜亂無(wú)章，保持5%-10%的抗體活性。
右圖海貍公司采用定向包被技術(shù)，保證抗體的活性端充分暴露，保持抗體100%的活性。
自主研發(fā)磁珠
作為國內最大、種類(lèi)最全的磁珠生產(chǎn)商之一，蘇州海貍生物醫學(xué)工程有限公司以國際領(lǐng)先的生物納米表面技術(shù)和高效生物試劑技術(shù)為核心，開(kāi)發(fā)了一系列生物醫用磁珠及試劑盒。其中，磁珠類(lèi)產(chǎn)品線(xiàn)囊括了多個(gè)領(lǐng)域，包括特異性標記與捕獲，蛋白快速分離與純化，核酸提取與文庫構建，及高通量、自動(dòng)化生物樣本處理綜合技術(shù)平臺。目前，海貍公司已經(jīng)發(fā)展成為一家集自主研發(fā)、規?；a(chǎn)和銷(xiāo)售服務(wù)于一體的生物醫學(xué)工程領(lǐng)域高科技企業(yè)。
海貍公司磁珠的微觀(guān)形貌
a）Mag COOH-2000掃描電鏡顯微鏡圖，該磁珠的粒徑分布均一，為2微米。表面光滑，能夠降低部分非特異性吸附。
b）Mag NH2-500偶聯(lián)SA蛋白后的掃描電鏡顯微鏡圖片。采用海貍納米科技表面技術(shù)包被的SA磁珠能夠保證SA蛋白的均勻包被，且避免磁珠的粘連。
c）磁性瓊脂糖微球的顯微鏡成像圖片。采用納米級磁核，填充于30-150μm的瓊脂糖微球內，形成載量極高的微球。對抗體的結合量達30mg/mL磁性微球。
d）將Magrose NHS磁珠偶聯(lián)熒光蛋白后，在熒光顯微鏡中成像圖片。該磁珠能夠促使蛋白均勻分布，且保證蛋白的利用效率。
定制服務(wù)
海貍公司憑借先進(jìn)的技術(shù)優(yōu)勢和豐富的研發(fā)經(jīng)驗，創(chuàng )建了高端研發(fā)技術(shù)服務(wù)平臺，可提供全面的生物研究試劑服務(wù)。
服務(wù)內容：
1.磁珠偶聯(lián)蛋白；
2.磁珠偶聯(lián)多肽；
3.磁珠偶聯(lián)抗體；
4.磁珠與核酸相關(guān)偶聯(lián)等技術(shù)。
服務(wù)特色：
1.技術(shù)領(lǐng)先，經(jīng)驗豐富、富有開(kāi)創(chuàng )性的專(zhuān)業(yè)研發(fā)團隊；
2.專(zhuān)業(yè)的項目管理人才，完善的項目管理系統；
3.量身打造的定制生產(chǎn)，幫助客戶(hù)降低資金和時(shí)間成本。
海貍磁珠（BeaverBeads?）在化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的應用
可用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的磁珠，種類(lèi)如前面第三章所列。但其中，鏈霉親和素磁珠的使用最為廣泛，主要是因為親和素-生物素系統的通用型以及廣泛性。親和素-生物素系統（BAS）的主要特點(diǎn)如下列表。
| 靈敏度高 |
生物素容易與蛋白質(zhì)和核酸類(lèi)等生物大分子結合，并保持大分子物質(zhì)的原有生物活性。 每個(gè)親和素分子有四個(gè)生物素結合部位，可同時(shí)以多價(jià)形式結合生物素化的大分子衍生物和標記物。 因此，BAS具有多級放大作用，使其在應用時(shí)可極大地提高檢測方法的靈敏度。 |
| 穩定性好 |
生物素與親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價(jià)作用，親和常數（K）為1015mol/L，比抗原與抗體間的親和力至少高1萬(wàn)倍。 二者的結合穩定性好專(zhuān)一性強，不受試劑濃度，pH環(huán)境，抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響。 |
| 特異性強 | 親和素與生物素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度專(zhuān)一性。而且，BAS結合特性不會(huì )因反應試劑的高度稀釋而受影響，使其在實(shí)際應用中可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。 |
| 普適性廣 | 生物素-結合素系統的多功能性還能提供一套統一的研究方法，適合用于不同的項目體系。 |
| 其他 |
通用性強，可制成多種通用性試劑（如生物素化二抗）適用于不同的反應體系。 生物素與親和素的結合具高速、高效的特性，盡管BAS的反應層次較多，但所需的溫育時(shí)間很短。 |
海貍鏈霉親和素磁珠，是采用蘇州海貍生物醫學(xué)工程納米表面技術(shù)，將重組鏈霉親和素蛋白高密度定向包被到超順磁性微球表面，排列均勻，并朝向一致。產(chǎn)品具有較高的生物素結合效率和較低的蛋白及DNA非特異吸附。每mg磁珠的游離生物素結合量高達800pmol以上，生物素化抗體結合量為20μg以上。
海貍鏈霉親和素磁珠化學(xué)發(fā)光實(shí)驗結果
在配合全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測時(shí)，體現出很好的穩定性，以及與進(jìn)口品牌磁珠相當的靈敏性。
| 化學(xué)發(fā)光免疫檢測**項目 | ||||||
| Competitor D | ||||||
| RLU-1 | RLU-2 | RLU-3 | AVE | CV | Ratio(S/0) | |
| S0 | 17026 | 17033 | 17804 | 17288 | 2.6% | / |
| S1 | 34203 | 33911 | 36506 | 34873 | 4.1% | 2.0 |
| S2 | 53255 | 53405 | 52721 | 53127 | 0.7% | 1.5 |
| S3 | 183657 | 187146 | 168984 | 179929 | 5.4% | 3.4 |
| S4 | 791664 | 827481 | 795708 | 804951 | 2.4% | 4.5 |
| S5 | 2058123 | 2204629 | 2248230 | 2170327 | 4.6% | 2.7 |
| S6 | 3777841 | 3635292 | 3651176 | 3688103 | 2.1% | 1.7 |
| BeaverBeadsTMStreptavidin | ||||||
| RLU-1 | RLU-2 | RLU-3 | AVE | CV | Ratio(S/0) | |
| S0 | 9591 | 9817 | 9777 | 9728 | 1.2% | / |
| S1 | 28132 | 29311 | 26109 | 27851 | 5.8% | 2.9 |
| S2 | 43037 | 42372 | 44145 | 43185 | 2.1% | 1.6 |
| S3 | 179352 | 165282 | 181423 | 175352 | 5.0% | 4.1 |
| S4 | 764793 | 731704 | 776344 | 757614 | 3.1% | 4.3 |
| S5 | 1967593 | 1950715 | 1960135 | 1959481 | 0.4% | 2.6 |
| S6 | 3365758 | 3348558 | 3605662 | 3439993 | 4.2% | 1.8 |
檢測方法：雙抗夾心兩步法
結論
BeaverBeadsTMStreptavidin具有很好的穩定性能，CV值控制在5%以?xún)扰c進(jìn)口磁珠相當。
BeaverBeadsTMStreptavidin對非特異性具有良好的控制，S0明顯低于進(jìn)口磁珠。
BeaverBeadsTMStreptavidin的靈敏度較高，Ratio（S/0）比值控制在2.0，與進(jìn)口磁珠相當。
